Потенциал экологически безопасного пробиотического очищающего средства Препарат для снижения инфекционной активности вирусов, попавших в организм человека

Аннотация:

Пандемия COVID-19 оказала глубокое влияние на процедуры санитарной обработки, и для предотвращения распространения SARS-CoV-2 массово применялась дезинфекция высокого уровня, что потенциально негативно сказывалось на окружающей среде и угрозе развития устойчивости к противомикробным препаратам (AMR). Стремясь преодолеть эти опасения и при этом сохранить эффективность дезинфекции против оболочечных вирусов, мы оценили противовирусные свойства пробиотической системы очистки (PCHS), экологически устойчивого моющего средства на основе пробиотиков, которое ранее доказало, что стабильно снижает патогенное загрязнение и AMR. PCHS (разбавленный 1:10, 1:50 и 1:100) был протестирован в сравнении с обычными дезинфицирующими средствами (70% этанол и 0,5% гипохлорит натрия), в тестах на суспензию и носитель, в соответствии с европейскими стандартами UNI EN 14476:2019 и UNI EN 16777:2019. В исследование были включены альфа- и бета-коронавирусы человека hCoV-229E и SARS-CoV-2, герпесвирус человека типа 1, вирусы гриппа человека и животных, а также вирус вакцины. Результаты показали, что PCHS способно инактивировать 99,99% всех протестированных вирусов в течение 1 -2 ч после контакта, как в суспензии, так и на поверхности. Примечательно, что в то время как контрольные дезинфицирующие средства становились неактивными в течение 2 ч после применения, противовирусное действие PCHS сохранялось до 24 ч после нанесения, что позволяет эффективно предотвращать распространение вирусов через загрязненную среду, не усугубляя загрязнения окружающей среды и проблемы AMR.

Keywords: enveloped virus decontamination; SARS-CoV-2 inactivation; prevention; infection control; eco-friendly disinfection
Ключевые слова: инактивация вируса SARS-CoV-2; профилактика; инфекционный контроль; экологичная дезинфекция; обеззараживание оболочечных вирусов

1.        Введение

Пандемия COVID-19, вызванная новым коронавирусом человека SARS-CoV-2, оказала глубокое влияние на привычки, связанные с гигиеной и санитарией, проливая свет на риск, связанный с заражением вирусами окружающей среды, особенно в больничных условиях. COVID-19 фактически распространился по всему миру, вызвав на данный момент более 244 миллионов подтвержденных случаев заболевания и 4,96 миллиона смертей [1]. Инфекция SARS-CoV-2 передается в основном респираторно-капельным путем, но, по имеющимся данным, вирус может сохраняться до нескольких дней на неодушевленных твердых поверхностях, по крайней мере в контролируемых лабораторных условиях [2,3], что указывает на потенциальный вклад в передачу инфекции через прямой контакт с поверхностями и фомитами, загрязненными капельками или другими жидкостями организма [4-9]. Хотя окончательно доказать передачу инфекции через фомиты сложно [10], было зарегистрировано несколько случаев [11,12], и риск заражения был оценен в связи с возможной передачей инфекции от рук к фомитам [8,13,14].

В соответствии с этими данными ВОЗ предложила профилактические меры, а регулирующие органы ввели в обязательном порядке высоковируцидные химические дезинфицирующие средства для очистки поверхностей в помещениях, включая медицинские и не медицинские учреждения, в качестве временных рекомендаций по борьбе с чрезвычайной ситуацией в области здравоохранения, вызванной COVID-19 [10,15]. Однако, как показывают наблюдения за другими микроорганизмами, действие дезинфицирующих средств может быть временным и неспособным предотвратить повторную контаминацию, которая происходит постоянно из-за непрерывного распространения людей, находящихся в замкнутом пространстве [16]. Несмотря на первоначальную быструю инактивацию микробов, продезинфицированные поверхности могут быть быстро реконтаминированы, что может стать новым источником передачи инфекции. Кроме того, чрезмерное использование дезинфицирующих средств может представлять угрозу для людей [17], и существуют разногласия по поводу необходимости использования дезинфицирующих средств вместо моющих, особенно в медицинских учреждениях с низким уровнем риска или в не медицинских учреждениях [18,19]. Наконец, массовое использование дезинфицирующих средств может негативно повлиять на городскую среду и дикую природу [20], а также на водные экосистемы [21], а некоторые химические соединения, используемые для дезинфекции, как было доказано, отбирают или вызывают устойчивость к противомикробным препаратам (AMR) у патогенов, включая те, которые, как известно, оказывают важное влияние на клиническое лечение COVID-19 [22] [23-25]. Учитывая, что микробы AMR могут осложнить уход за пациентами с COVID-19 и что только от AMR уже умирают миллионы людей в год (более 37 000 человек только в Европейском союзе), очевидно, что дальнейшее распространение AMR может усугубить последствия будущих пандемий. Следовательно, существует острая необходимость в простых, эффективных, малотравматичных и, возможно, недорогих процедурах, обеспечивающих длительную дезинфекцию обрабатываемых поверхностей, преодолевая побочные эффекты, связанные с химической дезинфекцией.

Помимо SARS-CoV-2, было также показано, что несколько оболочечных вирусов сохраняют инфекционность на твердых поверхностях в течение длительного времени в зависимости от типа вируса, характеристик поверхности, температуры и влажности [26], включая коронавирусы человека, вирусы гриппа и герпесвирусы [27-29]. Также сообщалось, что вирусы парагриппа, гепатита В и С и ВИЧ-1 сохраняются на поверхностях и фомитах [30], которые могут представлять собой возможные резервуары вирусов и векторы передачи восприимчивым людям [28,31]. В соответствии с данными о присутствии и персистенции вирусов в больничной среде [30,32,33], что указывает на теоретический риск передачи вируса госпитализированным пациентам, стратегии, направленные на профилактику и контроль инфекций, включают гигиенизацию окружающей среды как часть этого процесса. Примечательно, что до недавнего времени вирусная составляющая больничного микробиома не учитывалась в стратегиях мониторинга, направленных на противодействие возникновению инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (HAIs/ИСМП) в клинических условиях, как это делается в отношении бактериальных и грибковых инфекций, хотя вирусная инфекционная опасность существует, даже если она минимальна.

Среди вирусов, которые могут передаваться через загрязненную среду, коронавирусы человека (оболочечные одноцепочечные РНК-вирусы с положительным смыслом), которые могут вызывать легкие и тяжелые респираторные инфекции [34], могут сохраняться на различных типах неодушевленных поверхностей, оставаясь заразными от 2 ч до 9 дней при комнатной температуре [3][4]. Аналогичным образом, вирусы гриппа (оболочечные одноцепочечные РНК-вирусы с отрицательным смыслом), тип А которых является наиболее вирулентным среди четырех типов гриппа [35], способны сохранять инфекционность до 48 ч на гладких поверхностях [36,37], а штамм H5N1 может сохраняться на стекле и стали более 13 дней при низкой относительной влажности и температуре [38]. Кроме того, человеческий герпесвирус Herpes simplex virus-1 (HSV-1; оболочечный вирус с двухцепочечной ДНК), возбудитель орального и генитального герпеса, может сохраняться на сухих неодушевленных поверхностях от нескольких часов до недели [28], а его передача может вызвать широкий спектр инфекций, от легких до угрожающих жизни, у людей с ослабленным иммунитетом или пациентов с ослабленным иммунитетом [39].

Учитывая способность многих вирусов сохранять инфекционность на неживых поверхностях, контроль вирусной контаминации окружающей среды представляет собой ключевой момент, требующий решения. Современные рекомендации по борьбе с COVID-19 предлагают использовать для дезинфекции высокоактивные дезинфицирующие средства, в основном 0,1- 0,5% гипохлорит натрия (NaClO) и 1%-перекись водорода (H₂O₂) [40]. Однако, несмотря на их быстрое действие [41], нет гарантии длительного действия для стабильного поддержания окружающей среды в обеззараженном состоянии. Напротив, согласно нашим и другим предыдущим исследованиям [16,42-44], обеззараженная среда может быть быстро повторно загрязнена, что приведет к сохранению уровня загрязнения в течение большей части дня.

Стремясь получить долгосрочную эффективную процедуру очистки, стабильно снижающую вирусную контаминацию без влияния на загрязнение окружающей среды и AMR, мы проверили противовирусные свойства экологически устойчивой санитарной системы на основе пробиотиков (PCHS, Probiotic Cleaning Hygiene System), которая, как было показано ранее, предотвращает повторное заражение патогенами путем стабильного ремоделирования больничного микробиома. Ее действие, основанное на биологических свойствах отдельных пробиотических видов Bacillus, содержащихся в экологически чистом моющем средстве, стабильно снижало количество устойчивых патогенов (-80%) [16,22,45-48] и сопутствующих инфекций (-52%) [44,46], а также оказывало значительное положительное влияние на потребление антимикробных препаратов (-60%) и затраты на терапию (-75%) [46]. Основываясь на этих наблюдениях, мы оценили противовирусную эффективность PCHS в отношении различных оболочечных вирусов, способных длительно сохраняться на поверхностях, а именно коронавирусов человека HCoV-229E и SARS-CoV-2, HSV-1, вирусов гриппа типа А человеческого (H3N2) и животного (птичий H10N1 и свиной H1N2) происхождения, а также модифицированный вирус вакцины Анкара (MVA), который является наиболее устойчивым среди оболочечных вирусов и по этой причине в обязательном порядке включен в европейские стандартные процедуры, используемые для оценки противовирусных свойств дезинфицирующих средств. Анализы проводились in vitro в соответствии с европейскими стандартными нормами для суспензионных и поверхностных тестов [49], проверяя как обеззараживающую, так и профилактическую активность PCHS по сравнению со стандартными дезинфицирующими средствами.

2. Материалы и методы

2.1. Моющее (очищающее) средство на основе пробиотиков

Пробиотическая система гигиены уборки (PCHS) (Copma Scrl, Феррара, Италия), использованная во всех анализах, была описана ранее [22]. Вкратце, она состоит из запатентованного EU Ecolabel (https://eur-lex.europa.eu/legal-content/EN/TXT/?uri=CELEX:32010R0066, доступ 23 октября 2021 г.) моющего средства, содержащего 10⁷ КОЕ/мл спор выбранных пробиотиков, принадлежащих к роду Bacillus (а именно B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium). PCHS тестировали при разведении 1:10, 1:50 и 1:100 в стерильной дистиллированной воде.

2.2. Вирусы и клетки

Оболочечные вирусы и соответствующие клетки-мишени, использованные для приготовления инокулята вируса, титрования вируса и стандартных анализов инактивации, приведены в Таблице 1.

Клетки MRC-5 культивировали в минимальной эссенциальной среде орла (EMEM) (Gibco, Grand Island, NY), а другие клеточные линии - в минимальной эссенциальной среде Dulbecco/Дульбекко (DMEM) (Gibco, Grand Island, NY). Все клеточные линии выращивали при 37°C + 5% CO₂ в соответствующей культуральной среде, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS), 2 мМ L-глютамина, 100 U/мл пенициллина и 100  μг/мл стрептомицина (полная среда для клеточных культур) (Gibco, Grand Island, NY).

Запасы вируса получали путем инфицирования специфических клеток-мишеней с 90% плотностью, которые затем инкубировали при соответствующей температуре (35°C для hCoV-229E и 37°C для всех остальных вирусов) + 5% CO₂ в культуральной среде, дополненной 2% FBS. Инфицированные культуры клеток инкубировали в течение различного времени до появления цитопатического эффекта (CPE/ЦПЭ), охватывающего >80% культивируемых клеток, что соответствовало: 2 дня для MVA и HSV-1, 5 дней для SARS-CoV-2, 3 дня для вирусов гриппа и 7 дней для hCoV-229E. По окончании времени инкубации клетки и культуральные супернатанты собирали. Клетки лизировали с помощью 3 циклов быстрого замораживания/оттаивания в жидком азоте при 37°C, перемежающихся 30-секундным импульсным вихревым движением. Затем лизат клеток добавляли к культуральному супернатанту и вирусные частицы извлекали центрифугированием при 20 000x g в течение 45 мин при 4 °C Гранулы вируса суспендировали в 1 мл PBS + 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), затем замораживали и хранили при -80 °C до использования. Титр вируса определяли путем заражения соответствующих клеток-мишеней, высеянных в 96-луночные планшеты, в тех же условиях, что и при приготовлении вируса, и оценивали 50%-ную инфекционную дозу культуры ткани TCID₅₀ на мл стандартным методом Спирмена-Карбера, как описано ранее [50,51]. Вкратце, серийные разведения вирусных инокулятов добавляли к нескольким образцам клеток-мишеней, высеянных в 96-луночные планшеты, и регистрировали CPE после соответствующего времени инкубации. Титр вируса рассчитывали по следующей формуле, чтобы непосредственно оценить 50%-ную конечную точку.

Все запасы вирусов содержали около 10⁸ TCID₅₀/мл, как было рассчитано по методу Спирмена-Карбера.

2.3. Противовирусная активность: Испытания суспензии

Противовирусную активность PCHS в суспензии определяли по европейской стандартной процедуре UNI EN 14476:2019, разработанной Техническим комитетом 216 (TC216) «Химические дезинфицирующие средства и антисептики» Европейского комитета по стандартизации (CEN), который разрабатывает методы тестирования эффективности дезинфицирующих средств в Европе с 1989 года [49,52]. Вкратце, 10 μL суспензии вируса (соответствующей 10⁵-10⁷ TCID₅₀, в зависимости от типа вируса) добавляли к 9 μL соответствующего разведения PCHS (1:10, 1:50 и 1:100) в присутствии 0,3% BSA, чтобы имитировать условия, которые могут быть обнаружены на поверхности в больнице («чистые» условия). В качестве отрицательного и положительного контроля использовались культуральная среда и 70% этанол (EtOH). Суспензию инкубировали при комнатной температуре в течение 1, 2, 4, 8 и 24 ч; затем ее собирали, немедленно разводили в 0,9 мл холодной среды + 2% FBS (этап нейтрализации), фильтровали (0,45 μm) для удаления пробиотического компонента и затем серийно разводили (10-кратное разведение) в холодной среде + 2% FBS для титрования остаточного количества вируса по методу Спирмена-Карбера. Инфицированные клетки затем инкубировали при соответствующей температуре в присутствии 5% CO₂ в течение времени, необходимого для подтверждения CPE вируса. Репрезентативные изображения CPE показаны на Рисунке S1 в Дополнительных материалах. Инфекционный титр выражали как TCID₅₀/мл. Каждое экспериментальное условие оценивалось в двух экземплярах, а полученные результаты представляют собой средние значения трех независимых анализов. Все эксперименты с SARS-CoV-2 проводились в лаборатории BSL-III. Экспериментальный контроль и оценка цитотоксичности PCHS и стандартных дезинфицирующих средств проводились на всех типах клеток, используемых в анализах, в соответствии с протоколом, указанным в стандартных процедурах.

2.4. Противовирусная активность: Поверхностные тесты

Оценка противовирусной способности PCHS на твердых непористых поверхностях проводилась в соответствии с европейской стандартной процедурой UNI EN 16777:2019 [53] с использованием MVA и hCoV229E в качестве целевых вирусов. Процедура предусматривает проведение оценок на стерильных дисках из нержавеющей стали диаметром 2 см, которые были загрязнены в трех различных условиях, чтобы оценить соответственно: (1) способность PCHS обеззараживать ранее загрязненные вирусами поверхности, (2) краткосрочную способность обработанных PCHS поверхностей инактивировать последующее вирусное загрязнение, (3) долгосрочное действие PCHS в стабильном предотвращении последующего вирусного загрязнения. Каждый анализ проводился в присутствии 0,3% BSA в качестве органической нагрузки («чистые» условия). Вкратце, в анализах деконтаминации 100  μл инокулята вируса (соответствующего 10⁶ TCID₅₀) высевали на поверхность носителя с помощью микропипетки, каплю распределяли по поверхности диаметром около 1 см и оставляли высыхать при комнатной температуре, затем сразу же покрывали 100 μL PCHS, предварительно разведенного 1:10, 1:50 и 1:100 в воде. EtOH 70% и культуральная среда использовались в качестве положительных и отрицательных контролей, соответственно. Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч добавляли 0,9 мл (10-кратное разведение) ледяной холодной среды + 2% FCS для сбора остаточного вируса. Собранную среду фильтровали (0,45 μм) для удаления пробиотического компонента и серийно разводили (10-кратно) в холодной среде + 2% FCS. Каждое разведение переносили в 96-луночные микропланшеты (0,1 мл/лунку), содержащие монослой клеток с 90% конлюэнтностью, которые затем инкубировали в соответствующих условиях для оценки титра остаточного вируса по методу Спирмена-Карбера. В профилактическом анализе на поверхность высевали по 100 μL разбавленных 1:10, 1:50 и 1:100 PCHS и оставляли высыхать при комнатной температуре. EtOH 70% и культуральная среда использовались в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Сразу после высыхания на поверхности наносили 100 μл инокулята вируса (10⁶ TCID₅₀). Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч образцы собирали и титровали, как описано для анализа деконтаминации.  Долгосрочную способность PCHS предотвращать заражение вирусами определяли путем высева на поверхность 100  μл PCHS в разведении 1:10, 1:50 и 1:100 и последующего заражения обработанной поверхности через 1, 2, 4, 8 и 24 ч 100  μл инокулята вируса (10⁶ TCID₅₀). В качестве положительных контролей использовали EtOH 70% и гипохлорит натрия (NaClO) 0,5%; в качестве отрицательного контроля использовали культуральную среду. Инокулят вируса оставляли на 2 ч, затем собирали и титровали, как описано в предыдущих анализах. Экспериментальный контроль и оценка цитотоксичности PCHS и стандартных дезинфицирующих средств проводились на всех типах клеток, используемых в анализах, в соответствии со стандартными процедурами. EtOH и NaClO были цитотоксичны при разведении 10^-1 для всех использованных клеточных линий, тогда как PCHS не проявлял клеточной токсичности; поэтому прямое сравнение титра вируса проводили при разведении от 10^-2 и далее.

2.5. Анализ ферментативной активности пробиотиков

Штаммы Bacillus, содержащиеся в детергенте PCHS (а именно B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium), ранее выделенные в культуре, были оценены с помощью системы API-ZYM (BioMérieux, Флоренция, Италия) на предмет их способности производить ферменты, потенциально полезные для деградации компонентов вируса, в соответствии с инструкциями производителя.

2.6. Статистический анализ

Статистический анализ проводили с помощью программного обеспечения Agilent GeneSpring GX v11.5 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) и R (R 2019, R Core Team, доступно как бесплатное программное обеспечение на сайте https://www.r.project.org/, доступ на 10 мая 2021 г.) по критерию Стьюдента. Значимым считалось значение p ≤ 0,05. 

3. Результаты

3.1. Противовирусная активность PCHS в суспензии

Результаты, полученные при измерении противовирусной активности PCHS на указанных оболочечных вирусах в условиях суспензии (в соответствии со стандартной европейской процедурой UNI EN 14476:2019), показали, что PCHS эффективно инактивирует все протестированные вирусы, независимо от типа используемого вируса (Рисунок 1), включая MVA, который является единственным оболочечным вирусом, включенным в обязательном порядке в стандартные рекомендации, и считается наиболее устойчивым среди вирусов, снабженных оболочкой. Более подробная информация (Рисунок 1А): более высокие концентрации PCHS обеспечивали инактивацию MVA на уровне >4 Log в течение 1 ч после контакта (-6,1 и -5,1 Log для разведений 1:10 и 1:50, соответственно), в то время как разведение 1:100 обеспечивало -2,7 Log через 1 ч, но снижение >4 Log в течение 2 ч (-4,3 Log), что соответствует требованиям стандарта UNI EN 14476:2019 по эффективности продукта с противовирусной активностью против определенного типа вируса. Снижение инфекционного титра вируса увеличивалось в зависимости от времени в последующие периоды инкубации (4, 8 и 24 ч).

Рисунок 1. Противовирусная активность PCHS в суспензионных тестах, проведенных на указанных оболочечных вирусах.

(A) Титр вируса модифицированной вакцины (MVA) после контакта с PCHS в указанных разведениях, измеренный в клетках-мишенях BHK.

(B) Титр вируса HSV-1 после контакта с PCHS в указанных разведениях, измеренный в клетках-мишенях Vero.

(C) Титр вируса hCoV-229E после контакта с PCHS в указанных разведениях, измеренный в клетках-мишенях MRC-5.

(D) Титр вируса SARS-CoV-2 после контакта с PCHS (разведение 1:100), измеренный в клетках-мишенях Vero.

(E) Титры вирусов гриппа человека и животных после контакта с PCHS (разведение 1:100), измеренные в штаммах свиного H1N2, человеческого H3N2 и птичьего H10N1; остаточный титр вируса измерялся в клетках-мишенях MDCK.

Положительный контроль инактивации вируса был представлен 70% EtOH в каждом анализе. Результаты выражены в виде Log₁₀ TCID₅₀/мл и представляют собой средние ± SD значения дубликатов трех независимых анализов для каждого типа вируса.

На Рис. 1В показаны результаты, полученные при использовании HSV-1, которые подтвердили и расширили результаты, наблюдаемые при использовании MVA. При любом разведении PCHS в течение 1 ч после контакта наблюдалась инактивация вируса более чем на 4 Log. Высокое разведение продукта (1:100) обеспечивало снижение уровня вируса на 4,9 Log в течение 1 ч, а более высокие концентрации PCHS (1:10 и 1:50) полностью инактивировали исходный титр вируса, зарегистрировав снижение на 7,0 Log. Аналогично, результаты, полученные против человеческого альфа-коронавируса hCoV-229E (Рис. 1С), показали инактивацию 4,9 Log за 1 ч контакта при разведении 1:100 и отсутствие остаточного вируса при более высоких концентрациях (-6 Log). В более поздние сроки (2, 4, 8 и 24 ч) инактивация hCoV-229E была полной, остаточный вирус не обнаруживался.

Рисунок 1. Противовирусная активность PCHS в суспензионных тестах, проведенных на указанных оболочечных вирусах. 

Аналогичную противовирусную активность PCHS проявлял и в отношении SARS-CoV-2 (Рис. 1D), который инактивировался на уровне > 4 Log (-4,1 Log) при разведении 1:100 в течение 1 ч после контакта. Инактивация была полной через 2 и 4 ч после контакта, так как остаточный вирус в это время не обнаруживался. На основании полученных результатов и аналогично анализу SARS-CoV-2, только разведение 1:100 PCHS было протестировано против вирусов гриппа с использованием времени контакта 1, 2, 4, 8 и 24 ч. Результаты (Рис. 1E) показали, что штаммы человека и животных были по-разному чувствительны к активности PCHS, причем наиболее восприимчивым оказался штамм свиньи H1N2, а наиболее устойчивым - птичий штамм H10N1. Вирус свиньи H1N2 был инактивирован PCHS в течение 1 ч на >4 Log (-4,4 Log), тогда как человеческий штамм H3N2 показал снижение на 2,5, 3,5 и 4,9 Log, а птичий штамм H10N1 - на 2,1, 3 и 4,5 Log через 1, 2 и 4 ч, соответственно.

3.2. Противовирусная активность PCHS на поверхности

Поскольку в суспензионном методе вирусы контактируют с большим количеством дезинфицирующего средства, что может облегчить их инактивацию, противовирусную активность PCHS также оценивали в кариотестах, проведенных в соответствии со стандартной европейской процедурой UNI EN 16777:2019. На основании результатов, полученных в суспензионных тестах, в них использовались только вирусы hCoV-229E и MVA, а также коронавирус человека, сходный с SARS-CoV-2, и высокоустойчивый оболочечный вирус. Были протестированы три различных условия, чтобы оценить соответственно: (1) обеззараживающую способность PCHS, (2) способность PCHS предотвращать вирусную контаминацию PCHS, (3) долгосрочную стабильность активности PCHS в предотвращении вирусной контаминации.

Результаты анализов деконтаминационного типа показали, что, как и в суспензионных тестах, любое разведение PCHS полностью инактивирует hCoV-229E (снижение >4 Log) в течение 1 ч, тогда как MVA полностью инактивируется через 1 ч при разведениях 1:10 и 1:50 и через 2 ч при разведениях PCHS 1:100 (Рис. 2). Однако самая низкая концентрация PCHS вызывала снижение титра MVA на 2,5 Log в течение 1 ч.

Далее оценивалась способность обработанных PCHS поверхностей предотвращать последующее заражение вирусом. Для этого PCHS сначала наносили на поверхность и оставляли до высыхания, затем на обработанную поверхность наносили инокулят вируса, остаточный титр которого оценивали через 1, 2, 4, 8 и 24 ч контакта. Результаты, представленные на Рисунке 3, показали, что поверхности, обработанные PCHS, могут инактивировать последующие контаминирующие вирусы, обеспечивая полную инактивацию hCoV-229E в течение 1 ч при любом разведении PCHS, тогда как MVA был полностью инактивирован через 1 ч при разведении PCHS 1:10 и 1:50 и через 2 ч при разведении PCHS 1:100, соответственно. Однако через 1 ч после контакта разбавленный 1:100 PCHS приводил к снижению титра MVA на 3 лога. Следует отметить, что 70% EtOH оказался менее активным, чем PCHS, в инактивации обоих вирусов, что позволяет предположить, что испарение, вызванное высыханием на поверхности, привело к частичной потере действия.

Рисунок 2. Активность PCHS в тестах на обеззараживание поверхностей. Анализы проводили путем нанесения указанных разведений PCHS (1:10, 1:50 и 1:100) на поверхности, предварительно контаминированные индифицированными вирусами. Пробы отбирали через 1, 2, 4, 8 и 24 ч, а остаточный титр вируса оценивали по методу Спирмена-Карбера. В качестве контроля использовали 70% EtOH; результаты выражены как Log₁₀ TCID₅₀/мл и представляют собой средние ± SD значения дубликатов образцов из трех независимых анализов. А) Результаты анализа hCoV-229E. B) Результаты MVA.

Рисунок 3. Способность PCHS предотвращать заражение вирусами на обработанной поверхности. Анализ проводили путем нанесения PCHS на поверхность (разведения 1:10, 1:50 и 1:100), оставляли до высыхания и сразу же контаминировали обработанные поверхности указанными вирусами. Через 1, 2, 4, 8 и 24 ч отбирали образцы и оценивали остаточный титр вируса по методу Спирмена-Карбера. В качестве контроля использовали 70% EtOH; результаты выражены в виде Log₁₀ TCID₅₀/мл и представляют собой средние ± SD значения дубликатов образцов из трех независимых анализов. (A) Результаты анализа hCoV-229E. (B) Результаты MVA.

И наконец, на поверхностях оценивалась долгосрочная способность PCHS предотвращать заражение вирусами. PCHS (разбавленный 1:10, 1:50 и 1:100) наносили на поверхности и оставляли до высыхания, затем на обработанные поверхности добавляли инокулы вирусов через 1, 2, 4, 8 и 24 ч. Вирусы оставляли на месте в течение 2 ч, а затем собирали для измерения остаточного титра вирусов (Рис. 4).

Рисунок 4. Долгосрочная способность PCHS предотвращать заражение вирусами на обработанной поверхности. Анализы проводили путем нанесения PCHS на поверхность (разведения 1:10, 1:50 и 1:100), оставляли до высыхания и оставляли на поверхности на 1, 2, 4, 8 и 24 ч. После этого обработанные поверхности заражали указанными вирусами. Через 2 ч отбирали образцы и оценивали титр остаточного вируса по методу Спирмена-Карбера. В качестве контроля использовали 70 % EtOH и 0,5 % NaClO. Результаты выражены в виде Log₁₀ TCID₅₀/мл и представляют собой средние ± SD значения дубликатов трех независимых анализов. 

(A) Результаты анализа hCoV-229E. (B) Результаты MVA.

Примечательно, что поверхности, обработанные PCHS, полностью инактивировали оба вируса даже через 24 ч после обработки, в то время как поверхности, обработанные EtOH и NaClO, не сохраняли свою инактивирующую способность в течение длительного времени. EtOH терял свою инактивирующую активность в течение 1 ч, а NaClO постепенно терял свою вируцидную активность с 2 ч как в отношении MVA (-2,25 Log через 2 ч), так и в отношении hCoV-229E (-3,4 Logs): в это время активность NaClO была ниже порога, необходимого для определения соединения как вируцидного (- 4 Logs). При более длительном воздействии противовирусная активность обоих химических дезинфектантов полностью исчезала.

3.3. Энзиматическая активность PCHS-пробиотиков

Чтобы выяснить возможный вклад пробиотиков в инактивацию вирусов, штаммы Bacillus, полученные из PCHS, были проанализированы на предмет их ферментативной активности, чтобы выявить возможную продукцию ферментов, способных разлагать вирусные компоненты. Три штамма Bacillus, входящие в состав детергента PCHS (B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium), были индивидуально протестированы с помощью системы API-ZYM, что позволило одновременно идентифицировать и количественно оценить 19 различных ферментативных активностей.

Таблица 2. Ферментативная активность штаммов PCHS-Bacillus (*).

(*) Активность каждого фермента выражается в баллах от 0 до 5 в соответствии с интенсивностью реакции по сравнению с контролем, как указано в инструкции производителя.

Результаты, представленные в Таблице 2, показали, что каждый штамм проявляет несколько видов ферментативной активности, включая щелочную и кислую фосфатазу, эстеразу и эстеразу липазы, лейциновую и валиновую ариламидазы (B. pumilus и B. megaterium), α-химотрипсин (B. pumilus и B. megaterium), нафтол-фосфогидролаза, α- и β-галактозидаза (отсутствуют соответственно у B. megaterium и B. subtilis), α- и β-глюкозидаза, N-ацетил-β-глюкозамидаза и α-маннозидаза (только у B. pumilus). Наличие ферментов, способных перерабатывать липиды, белки и сахара, подтверждает гипотезу о том, что такие пробиотики могут химически разрушать внешние компоненты оболочечных вирусов, достигая их инактивации.

4. Обсуждение результатов

Пандемия COVID-19, вызванная SARS-CoV-2, оказала значительное влияние на процедуры санитарной обработки, и для предотвращения распространения вируса было показано массовое использование дезинфицирующих средств. С другой стороны, по имеющимся данным, контаминация вирусного происхождения была подтверждена для нескольких вирусов, помимо SARS-CoV-2 [33], что, возможно, способствовало возникновению инфекций вирусного происхождения, связанных с оказанием медицинской помощи [32], включая оболочечные и необолочечные вирусы, связанные с респираторными, слизисто-кожными, передающимися через кровь и педиатрическими заболеваниями [32,54]. Однако использование химических дезинфицирующих средств значительно возросло во время пандемии COVID-19, для борьбы с распространением SARS-CoV-2 [3,40] [3,40,41,55,56], а также были предложены новые системы дезинфекции [57]. Тем не менее, некоторые эффективные химические дезинфектанты могут быть токсичны для человека и должны применяться только в отсутствие людей [58], и даже при оптимальной практике очистки и дезинфекции, повторное загрязнение окружающей среды и оборудования происходит быстро, из-за временного действия дезинфектантов, что в конечном итоге позволяет повторную контаминацию [16,59,60]. Более того, как отметила ВОЗ в недавней редакционной статье [61], нынешнее массовое использование химических дезинфицирующих средств может усугубить как загрязнение окружающей среды, так и AMR [24,62,63].

Напротив, недавно мы сообщили, что санитарный подход, основанный на принципе микробиомного баланса (PCHS, Probiotic Cleaning Hygiene System), может стабильно и эффективно противостоять патогенам по сравнению с химическими дезинфицирующими средствами за счет механизмов конкурентного исключения [64], уменьшая количество патогенов на 80% по сравнению с химическими дезинфицирующими средствами [16,22,47,65], не отбирая устойчивые микробы, а снижая существующий AMR до 99.9% [46,48,66], а также снижая заболеваемость HAI (-52%) и потребление лекарств, связанное с HAI (-65%) [46].

Исходя из этих предпосылок и принимая во внимание текущую чрезвычайную ситуацию, связанную с COVID-19, мы поставили перед собой цель оценить противовирусный потенциал PCHS против оболочечных вирусов, потенциально контаминирующих медицинские учреждения, включая SARS-CoV-2. PCHS тестировали в соответствии с процедурами суспендирования и поверхностного анализа, согласно европейским стандартам UNI EN 14476:2019 и UNI EN 16777:2019. Действительно, обе процедуры предписывают использование неразвитых вирусов и только MVA среди оболочечных (поскольку он считается наиболее устойчивым оболочечным вирусом); однако, поскольку целью нашего исследования был анализ оболочечных вирусов, потенциально способных персистировать на поверхностях и сходных с SARS-CoV-2, мы включили, помимо MVA, коронавирусы человека hCoV-229E и SARS-CoV-2, герпесвирус человека HSV-1 и три вируса гриппа типа А человека/животных. Были протестированы три различные концентрации PCHS, включая низкую, которая используется для обычной уборки (разведение 1:100), и две более высокие концентрации (разведения 1:10 и 1:50), при сравнении их активности с 70% EtOH и 0,5% NaClO, двумя обычными дезинфицирующими средствами, применяемыми для дезинфекции во время пандемии. Основываясь на стандартных процедурах оценки вирусоцидных свойств продукта, в качестве порогового значения для определения противовирусной активности продукта в отношении конкретного вируса мы рассматривали снижение титра вируса в течение 1 ч на ≥4-Log₁₀.

Результаты показали, что PCHS был активен в отношении всех оболочечных вирусов во всех разведениях в зависимости от времени. В частности, разведение 1:100 полностью инактивировало в течение 1 ч все протестированные вирусы, за исключением MVA, который был инактивирован через 2 ч. В отношении вирусов гриппа наблюдалась различная ситуация, что подтверждает данные, полученные ранее для химических дезинфектантов, проявляющих различную активность в зависимости от типа вируса и происхождения хозяина [67]. Действительно, PCHS в разведении 1:100 инактивировал вирус свиньи в течение 1 ч, в то время как для инактивации вирусов человека и птиц требовалось 2-4 ч, что позволяет предположить, что для достижения инактивации в более короткие сроки следует использовать более высокие концентрации PCHS против этих штаммов.

Результаты тестирования носителя/поверхности, проведенного на hCoV-229E и MVA, показали высокую инактивирующую активность как в условиях деконтаминации, так и профилактики. Интересно, что в то время как 70% EtOH и 0,5% NaClO становились неактивными в течение 1 и 2 ч соответственно, поверхности, обработанные PCHS, сохраняли свои противовирусные свойства даже через 24 ч после нанесения PCHS, что позволяет предположить, что ежедневная санация PCHS (как это обычно делается при обычной уборке) может обеспечить постоянную стабильно деконтаминированную среду.

Известно, что поверхностно-активные вещества, содержащиеся в детергенте, разрушают и повреждают оболочку вирусов [55,68], и, таким образом, могут, по крайней мере частично, объяснять противовирусное действие PCHS. Однако длительное действие детергента на поверхности трудно объяснить только ПАВ, и мы предположили, что за непрерывное действие может отвечать выработка ферментов штаммами PCHS-Bacillus, распространившимися на обработанной поверхности. Соответственно, анализ ферментов, продуцируемых тремя видами Bacillus, полученными из PCHS (B. subtilis, B. pumilus и B. megaterium), выявил несколько видов ферментативной активности, потенциально способных разрушать компоненты оболочки вируса, включая липиды, белки и остатки сахаров. В соответствии с этим, род Bacillus известен как один из важнейших бактериальных источников ферментов с замечательными свойствами, такими как высокая устойчивость к экстремальным температурам, рН, органическим растворителям и окислителям. Энзимы Bacillus давно используются в медицине, для разрушения биопленок, кормов для животных, в сельском хозяйстве, для деградации перьев, шерсти и волос [69,70], что подтверждает их способность разрушать внешние компоненты вирусов. Действительно, такая деятельность ранее была связана с эффективным снижением микробного загрязнения на 99,9% [71], что позволяет предположить, что она может быть применима и против вирусов. Кроме того, бактерии, принадлежащие к роду Bacillus, обладают способностью к споруляции, что делает их устойчивыми к суровым условиям окружающей среды и пригодными для использования в концентрированных моющих средствах, что делает их интересными для использования в медицинских и промышленных целях. Наконец, PCHS - это недорогая доступная система, что также важно с точки зрения экономии средств [72], и делает ее потенциально применимой в различных антисанитарных средах, включая школы, офисы, общественный транспорт, а также в странах с низким уровнем дохода. Следует отметить, что стандарт UNI EN 14885:2018 указывает на два типа дезинфекции в медицине человека: быструю (в течение 5 мин) для критических зон пациента и медленную (в течение 1 ч) для остальных зон [73]. В этом отношении PCHS обеспечивает медленную дезинфекцию, но его стабильная деконтаминирующая активность в течение 24 часов позволяет предположить, что он может длительное время защищать обрабатываемую среду, что также соответствует недавним указаниям CDC относительно возможности того, что в отсутствие людей с подтвержденным/подозреваемым COVID-19 ежедневная уборка может быть достаточной для удаления вируса с поверхностей и поддержания здорового состояния объекта [19]. Однако для не медицинских учреждений было бы уместно проверить эффективность PCHS также в присутствии большого количества органической почвы («грязные» условия), поскольку в несанитарных помещениях может быть больше органических веществ по сравнению с больничными помещениями. Более того, поскольку сухая биопленка становится все более серьезной проблемой на поверхностях, было бы интересно проверить действие PCHS на это микробное тело. Наконец, было бы интересно расширить анализ и на неразвивающиеся вирусы, чтобы оценить возможное противовирусное действие против этих более устойчивых вирусов.

5. Выводы

В свете его эффективной длительной противовирусной активности и характеристик устойчивости, санация PCHS может рассматриваться как новая и безопасная перспектива для контроля и предотвращения распространения различных оболочечных вирусов, включая SARS-CoV-2, а также в свете отсутствия негативных побочных эффектов на здоровье окружающей среды и проблемы AMR.

Дополнительные материалы:

Следующее доступно онлайн на сайте www.mdpi.com/1999-4915/13/11/2227/s1, Рисунок S1: Репрезентативные изображения контрольных и инфицированных клеток, инокулированных остаточным вирусом после 1 и 24 часов контакта с PCHS в указанных разведениях.

Авторский вклад:

Концептуализация, E.C.; методология, E.C., F.B. и S.M.; валидация, F.B., W.R. и S.M.; формальный анализ, E.C.; исследование, M.D. и I.S.; ресурсы, S.M.; курирование данных, W.R.; написание - подготовка первоначального проекта, E.C.; написание - рецензирование и редактирование, E.C. и W.R. Все авторы прочитали и согласились с опубликованным вариантом рукописи.

Финансирование:

Данное исследование финансировалось фондом POR FESR Emilia Romagna (грант № PG/2020/362659, «Bando per sostenere progetti di ricerca ed innovazione per lo sviluppo di soluzioni finalizzate al contrasto dell'epidemia da COVID-19»; Эмилия-Романья, Италия).

Заявление Совета по институциональному надзору:

Не применимо.

Заявление об информированном согласии:

Не применимо.

Заявление о доступности данных:

Все данные, представленные в этом исследовании, содержатся в статье или в Дополнительных материалах к ней.

Благодарности:

Мы благодарим Институт вирусологии и иммунологии Бернского университета (Швейцария) за предоставленный вирус SARS-CoV-2. Мы признательны за отличную техническую поддержку Франческе Бини и Элеоноре Маццига.

Конфликты интересов:

Авторы не имеют конфликта интересов.

Литература